研究背景

microRNA（miRNA）通過抑制靶基因的翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。之前的工作已經(jīng)確定了miRNA在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）活性中的作用。環(huán)狀RNA（circRNA）是否參與VSMC中miRNA活性的調(diào)節(jié)尚不清楚。

研究目的

識(shí)別與VSMCs富含的miRNA相互作用并調(diào)控細(xì)胞活性的circRNA。

研究方法和結(jié)果

1）公共數(shù)據(jù)挖掘：

已發(fā)表人VSMCs RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定所有VSMCs生物學(xué)重復(fù)中共有的穩(wěn)健表達(dá)的circRNA；

2）RNA-seq：

小鼠主動(dòng)脈的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)（RNA提取前去除了內(nèi)膜和外膜層），鑒定人類和小鼠VSMCs之間保守的circRNA；

3）靶向miRNA分析：

對于之前在VSMC具有重要生物學(xué)作用的miRNA，至少包含其中2個(gè)miRNA的保守結(jié)合位點(diǎn)：只有一個(gè)circRNA具有miR-145-5p結(jié)合位點(diǎn)，在小鼠和人之間是保守的。（小鼠中已被命名為circ_1529，人類中命名為circ_8932，其來源基因?yàn)長rp6，其至少具有7個(gè)miR-145-5p結(jié)合位點(diǎn)）

4）驗(yàn)證VSMC中富含circ_Lrp6：

divergent primer擴(kuò)增cDNA和gDNA，驗(yàn)證其來源于可變剪接；RNAse R抗性檢測；放線菌素D處理抑制轉(zhuǎn)錄證實(shí)circRNA的穩(wěn)定性（更長的turn-over時(shí)間）；qRT-PCR檢測各組織中circ_Lrp6表達(dá)水平并結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：circ_Lrp6和Lrp6在血管中富集。

5）Circ_Lrp6是miR-145的海綿分子

共定位實(shí)驗(yàn)：若二者互作應(yīng)共定位，原位雜交和核/細(xì)胞質(zhì)分離評估它們在小鼠原代VSMC中的定位，在細(xì)胞質(zhì)中高度富集；

評估circ_Lrp6對miR-145活性影響：構(gòu)建circ_Lrp6過表達(dá)和shRNA載體，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)，證實(shí)circ_Lrp6對Itgβ8等miR-145各靶基因的作用直接依賴于miR-145與共靶mRNA 3’UTR的結(jié)合。

circ_Lrp6與miR-145直接結(jié)合：AGO2 IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者與AGO2結(jié)合（circRNA與miRNA的結(jié)合由AGO2介導(dǎo)）；RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者之間直接結(jié)合；等。

6）circ_Lrp6在VSMC中的生物學(xué)作用

LOF和GOF實(shí)驗(yàn)：劃痕實(shí)驗(yàn)等證實(shí)circ_Lrp6沉默降低遷移能力和損害細(xì)胞增殖，增加了VSMC分化標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)；

血小板衍生生長因子（PDGF-BB）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）分別處理VSMC，在TGF-β處理的細(xì)胞中circ_Lrp6和miR-145表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)。

驗(yàn)證circ_Lrp6和miR-145表達(dá)是否隨病理改變：缺氧有助于血管疾病的發(fā)病機(jī)理，缺氧與強(qiáng)烈下調(diào)的miR-145相關(guān)。

7）Circ_Lrp6與血管疾病

不同病理狀況circ_Lrp6和miR-145表達(dá)分析：例如動(dòng)脈粥樣硬化血管患者中，miR-145的表達(dá)顯著降低，但circ_Lrp6沒有顯著變化，在復(fù)雜的病理學(xué)中兩個(gè)ncRNA在基因表達(dá)方面解離。

評估circ_Lrp6調(diào)節(jié)是否可能影響小鼠血管損傷模型中的病理反應(yīng)，檢測了在ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈狹窄模型中特異性敲低circ_Lrp6的抗增殖作用。

綜上，兩種ncRNA在小鼠和人類疾病的血管病變中受到不同的調(diào)節(jié)，并且circ_Lrp6的調(diào)節(jié)可能影響血管疾病的發(fā)展。

 

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