研究方法

將總?cè)嘶蛐∈竽X組織RNA進行DNA酶處理并去除rRNA，然后用RNase R處理以消化線性RNA。為了進一步富集circRNA，將剩余的線性RNA多聚腺苷酸化（poly A tailing）并使用poly（A）純化磁珠去除帶polyA尾的RNA分子。收集富含circRNA的上清液并將其片段化（溫和水解切口）以使circRNA線性化。從3’末端除去磷酸基團并在線性化RNA的5’末端添加磷酸基團后，對獲得的RNA庫進行多聚腺苷酸化，以與ONT測序方案一致。接下來進行ONT全長轉(zhuǎn)錄組建庫。

1、ONT circRNA測序方法

只有一小部分RNA是環(huán)狀的（例如，小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中去rRNA的RNA庫中僅占約0.1％）。作者采用上述方法進行circRNA-ONT測序，由于有些線性RNA分子對RNase R具有抗性，故而此方法比普通的去線性circRNA建庫多了一步：將剩余的線性RNA多聚腺苷酸化（poly A tailing）并使用poly（A）純化磁珠去除帶polyA尾的RNA分子。結(jié)果表明，該步驟使circRNA強烈富集。

2、circRNA nanopore測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出

人和小鼠circRNA文庫的納米孔測序分別產(chǎn)生0.67M和1.06M reads，其中3.2％和3.3％跨越circRNA BSJ（Back splice junction）位點。人和小鼠中分別鑒定到7,834和10,975個circRNA，其中1,319個在人和鼠中保守的circRNA。在最高表達和保守的circRNA中，發(fā)現(xiàn)眾所周知的腦circRNA，例如circRims1、circRims2、circHipk3、circCdyl和circZfp609。整個數(shù)據(jù)集中，分別來自人和小鼠的2,945和7,052個circRNA先前未在circBase中注釋。

兩個高豐度circRNA：Hipk3和Zfp609（具有可變3’剪接位點的新型外顯子）的外顯子分布圖分別顯示在下圖：

3、長讀長測序全面繪制circRNA外顯子-內(nèi)含子組成

將所有小鼠和人跨越BSJ reads與各自的參考基因組比對，并定量比對到外顯子或內(nèi)含子區(qū)域的堿基對的數(shù)量。為了將分析集中于更豐富的circRNA中的內(nèi)含子保留和其他可變剪接事件，僅進一步研究了具有10個或更多BSJ reads并具有高于3％的平均內(nèi)含子百分比的circRNA。作者發(fā)現(xiàn)3個人和4個小鼠circRNA具有內(nèi)含子保留，而39和57個circRNA包含分別在人和小鼠的RefSeq中未注釋的外顯子序列。CAMSAP1 是circRNA內(nèi)含子保留實例，其僅發(fā)生在人RNA中；LPXN circRNA是僅在人中表達的circRNA。

可選擇性外顯子使用是人和小鼠circRNA中的普遍現(xiàn)象，circRNA的可變剪接模式通常在小鼠和人之間共享。circRNAs中使用的大多數(shù)外顯子都在RefSeq中注釋，但值得注意的是，人和小鼠表達良好的外顯子（>5 reads）中1.9％（73個外顯子）和2.1％（96個外顯子）分別是新的、以前未在RefSeq中注釋過。僅觀察可變剪接的外顯子，人和小鼠中新外顯子的百分比分別增加到8.7％（21個外顯子）和6.8％（12個外顯子）。對于人circPPP6R2和circRBM23以及小鼠circBrsk2和circNrxn1（下圖A-D）顯示了廣泛的可變剪接事件實例，其中circPPP6R2為包含未注釋外顯子的circRNA的實例。

4、circRNA新外顯子使用進一步分析

將circRNA根據(jù)新外顯子使用分類為“隱蔽的circRNA外顯子”（與注釋的外顯子共享5’或3’剪接位點）或“獨特的circRNA外顯子”（全新的外顯子）。人類2,393個外顯子中的91個和小鼠中2,487個外顯子中的82個是獨特的circRNA外顯子，140和163個分別是隱蔽的circRNA外顯子。（所有單外顯子circRNA都被排除在該分析之外，因為在單個read中需要完全覆蓋檢測到的外顯子，這對于單個外顯子circRNA而言在技術(shù)上是不可能的。）作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)獨特的circRNA外顯子在40-200bp范圍內(nèi)，但也經(jīng)常觀察到3-6bp的非常短的外顯子（微外顯子）組。有趣的是，大多數(shù)circRNA特異性外顯子導致移碼突變或終止密碼子獲得，可能解釋了它們在線性mRNA翻譯中缺失，因此受到無義介導降解。

小結(jié)

納米孔測序技術(shù)提供了一種快速可靠的方法來繪制circRNA的特定外顯子組成。