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 分類: 智能制造

無縫克隆試劑盒原理

與傳統(tǒng)的雙酶切相比,無縫克隆過程不需要利用“內(nèi)切酶”,而是要借助“外切酶”形成dsDNA的粘性末端,并利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺口。
【注:內(nèi)切酶:水解DNA分子鏈內(nèi)部磷酸二酯鍵,生成寡/寡聚核苷酸的酶。外切酶:是在核酸鏈的末端,按序降解核苷酸的酶,產(chǎn)物是單個的核苷酸?!?/p>

Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix 作為新一代的無縫克隆試劑,專門針對多片段無縫組裝反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,可以一次實(shí)現(xiàn)多至5個插入片段的特定順序組裝克隆,無需特定限制性酶切位點(diǎn)。試劑盒中包含三種酶:T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶。

T5核酸外切酶:它能沿著5’→3’方向,降解dsDNA,形成產(chǎn)生黏性末端,便于與另外的同源末端進(jìn)行配對結(jié)合。

DNA聚合酶:相同的黏性末端互補(bǔ)配對之后,再通過DNA聚合酶將缺失的堿基修復(fù)。

DNA連接酶:DNA片段完全堿基互補(bǔ)配對完成之后,DNA連接酶進(jìn)一步催化其形成磷酸二酯鍵,將所有缺口補(bǔ)齊,實(shí)現(xiàn)無痕拼接,形成完整的DNA分子。
值得一提的是,這三種酶都可以在同一個溫度(50 ℃)下發(fā)揮良好的功能,整個反應(yīng)過程15 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化,完成定向克隆。


圖1:Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix方法原理圖。

產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)

與傳統(tǒng)克隆相比,無縫克隆具有以下優(yōu)勢:

不受載體&酶切位點(diǎn)&片段序列的限制,實(shí)現(xiàn)任意組裝;

操作簡單、快速、高效, 適用于所有載體在任意位點(diǎn)進(jìn)行定向克??;

無載體自連現(xiàn)象,克隆陽性率可達(dá) 95%以上;

一次實(shí)現(xiàn)多至5個插入片段的特定順序組裝克隆。

可組裝長達(dá)上百kb的DNA片段。

產(chǎn)品應(yīng)用

快速克隆

高通量克隆

無縫克隆

DNA定點(diǎn)突變。

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