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發(fā)布于 2023年2月20日

單細(xì)胞測(cè)序中，從樣本制備到文庫(kù)測(cè)序要經(jīng)過(guò)5個(gè)技術(shù)流程：?jiǎn)渭?xì)胞懸液制備、單細(xì)胞精準(zhǔn)捕獲&cDNA擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、以及數(shù)據(jù)分析步驟。上期分享了單細(xì)胞測(cè)序1丨單細(xì)胞懸浮液制備，主要介紹了從動(dòng)物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細(xì)胞懸浮液的基本方法和注意事項(xiàng)。接下來(lái)分享：如何精準(zhǔn)捕獲單細(xì)胞&cDNA擴(kuò)增等。

目前常見的捕獲單細(xì)胞技術(shù)方法有：微流控和微孔板法。本文通過(guò)基于微流控法的平臺(tái)-百創(chuàng)DG1000來(lái)精準(zhǔn)捕獲細(xì)胞，并進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄、cDNA合成與擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)，從而獲得每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。

1、芯片加樣

處理好的細(xì)胞懸液盡量在30min以內(nèi)上機(jī)實(shí)驗(yàn)，長(zhǎng)時(shí)間放置，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。按照一定的加樣順序，分別將細(xì)胞相、膠珠相（DG1000-3′ gel beads）、油相加入到芯片（圖1:左圖）對(duì)應(yīng)孔中，然后將芯片放入到百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀中（圖1:右圖），啟動(dòng)開關(guān)。

圖1：百創(chuàng)C1000芯片結(jié)構(gòu)（左圖）；百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀（右圖）

2、形成GEMs

儀器運(yùn)行后，通過(guò)控制流速的方法，使得在“Y型”接口處，一個(gè)膠珠會(huì)吸附單個(gè)細(xì)胞及逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液一起向右流動(dòng)。到了“十字”接口處，它們與油相接觸后，每一個(gè)油滴中會(huì)包裹著一個(gè)膠珠與一個(gè)細(xì)胞，也就是“油包水”（GEMs）結(jié)構(gòu)。

圖2：形成“油包水”的原理（左）；“油包水”（GEMs）結(jié)構(gòu)示意圖（右）。

引物結(jié)構(gòu)

百創(chuàng)DG1000-3′ gel beads（膠珠）上固定的引物由4部分組成：Read1、Cell Barcode、UMI、Poly(dT)VN。
Read 1: 是一段已知的短核昔酸序列,主要用于后續(xù)的上機(jī)測(cè)序
Cell Barcode：片段長(zhǎng)度54bp，種類約為88萬(wàn)種，一個(gè)膠珠對(duì)應(yīng)于一個(gè)特異Cell Barcode序列。
UMI：在 mRNA反轉(zhuǎn)錄后，每一個(gè)mRNA隨機(jī)連上一個(gè)UMI，可以通過(guò)計(jì)數(shù)不同的UMI，最終確定mRNA的數(shù)量。
Polv(dT)VN:與mRNA3’端的poly(A)結(jié)合,進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

圖3：引物結(jié)構(gòu)示意圖。

3、cDNA生成與擴(kuò)增

GEMs形成后，細(xì)胞裂解釋放出mRNA；同時(shí)膠珠也會(huì)自動(dòng)溶解，釋放出大量含有Barcode序列的引物，并利用引物末端的Ploy(dT)VN序列捕獲液滴中的mRNA，并在一個(gè)個(gè)GEM中獨(dú)立完成mRNA逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。隨后“油包水”結(jié)構(gòu)裂開，進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。

將擴(kuò)增得到的cDNA純化后，可用于后續(xù)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。由于每一個(gè)單細(xì)胞的cDNA文庫(kù)標(biāo)記上了細(xì)胞條形碼（Barcode）。測(cè)序時(shí)，就把攜帶相同Barcode的序列視為來(lái)自同一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到區(qū)分細(xì)胞的目的。

以上就是生成GEMs、mRNA逆轉(zhuǎn)錄、以及cDNA合成與擴(kuò)增的全部?jī)?nèi)容。下期會(huì)具體介紹數(shù)據(jù)分析指標(biāo)的意義。