miRNA參與調控蘋果嫩枝彎曲促進花芽形成的機制
Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.)
Plant Biotechnology Journal，2015

 

實驗結果

開花誘導在蘋果樹生命周期中發(fā)揮非常重要的作用，但是年輕的蘋果樹往往容易產生低質量的數量少的花芽。嫩枝彎曲可以促進產生較多的花芽，因此嫩枝彎曲成為蘋果樹一個非常重要的栽培性狀。樹嫩枝彎曲會產生一種新的長距離信號，從而改變樹的生長和發(fā)育。但是，響應嫩枝彎曲發(fā)生的花芽生長和開花誘導的分子調控機制并不清楚，尤其是miRNA是否在其調控中發(fā)揮作用以及具體的機制如何。本研究關注在花芽發(fā)育、開花誘導和發(fā)育、響應嫩枝彎曲過程中miRNA的潛在作用。

 

研究目的

解析蘋果樹響應嫩枝彎曲時，植物激素和miRNA協(xié)同調控花芽生長和開花誘導的分子機制，有助于解決年輕蘋果樹低質量花芽的問題。

 

材料方法

1.實驗材料：
生長六年大小的富士蘋果樹，分兩組進行嫩枝彎曲（110度）、對照處理（垂直嫩枝），分別在開花誘導的初期（early stage，ES）、中期（Middle stage，MS）和晚期（Later stage，LS）取花芽，分別提取RNA進行小RNA測序，6個花芽組織RNA混樣進行降解組測序。
2.測序方法：
小RNA seq，Biomarker Illunima Hiseq 2000 platform

 

技術路線

 

實驗結果

1. 富士蘋果樹在開花誘導時期響應嫩枝彎曲后的花芽生長
首先，研究富士蘋果樹在開花誘導時期，嫩枝彎曲處理后花芽生長情況。無論是對照還是嫩枝彎曲處理，從發(fā)育早期（ES）到晚期（LS），花芽的長度、寬度、干重都增加了。但是，嫩枝彎曲明顯增加了花芽的大小。此外，通過檢測花芽生長速率發(fā)現，花芽大小變化主要發(fā)生在花芽誘導的早期，即ES到MS時期；而且，在嫩枝彎曲處理下花芽生長速率明顯增加了。實驗結果還顯示，嫩枝處理組比對照組的開花速率明顯增大了。

2. 開花誘導時期花芽中激素含量的變化。
分別在開花誘導的三個時間點（ES, MS, LS），對嫩枝彎曲處理組和對照組的花芽中激素（生長素，AUX；脫落酸，ABA；細胞分裂素，CK；赤霉素，GA）含量進行檢測。分析了在嫩枝彎曲組合對照組，開花誘導過程中各種激素含量的變化。

3. 小RNA和降解組文庫構建和測序。
為了研究嫩枝處理和對照組在ES、MS和LS時期小RNA的情況，構建了6個miRNA文庫（CES, CMS, CLS, BES, BMS, BLS）并用Illunima Hiseq 2000進行了測序?？偣搏@得了14 095 388, 14 106 904, 15 242 433, 13 259 311, 15 969 504 和13 523 103 raw reads。此外，對這六個組織提取的總RNA構建了降解組文庫并進行了測序，總共獲得了30 762 927 (93.08%) clean reads。分別對文庫進行了插入片段大小分布的評估，對sRNA的長度進行了統(tǒng)計分析。

4. 已知miRNA的鑒定和表達模式分析。
為了鑒定蘋果中已知的miRNA，用BLASTN將這六個花芽的sRNAs比對到miRBase 18.0 和植物miRNA數據庫中?？偣搏@得了屬于41個miRNA家族的195個已知的miRNA。然后對已知miRNA的表達量進行了分析。

Fig1. 差異表達已知miRNA維恩圖

對同一處理不同發(fā)育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）篩選了差異表達miRNA并繪制了維恩圖。結果顯示，其中42個miRNA下調表達，20個miRNA上調表達。對不同處理相同發(fā)育時期樣品間（BES vs CES, BMS vs CMS and BLS vs CLS）篩選到124個差異表達miRNA，相對對照組，嫩枝彎曲處理組中68個下調表達，27個上調表達。

 

5. 新miRNA的鑒定和表達模式分析。
用栽培種蘋果（Malus domestica Borkh）作為參考基因組來預測潛在的新miRNA，共鑒定到137個新miRNA。對同一處理不同發(fā)育時期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）新miRNA進行差異表達分析并繪制了維恩圖。結果顯示，其中34個新miRNA隨著發(fā)育時期上調表達，24個新miRNA在嫩枝彎曲處理組表達高于對照組，23個新miRNA在對照組表達明顯高于嫩枝彎曲處理組。

對嫩枝彎曲處理組和對照組間的31個差異表達新miRNA進行表達層次聚類分析。結果顯示，根據表達模式可分為5個亞簇。其中Cluster 1中的6個新miRNA在嫩枝彎曲組表達量均高于對照組。Cluster 5中的新miRNA表達模式則與Cluster 1中相反。其他三簇中的19個新miRNA，無論在對照組還是嫩枝彎曲處理組，展現出較低的表達水平。

Fig2. 差異表達新miRNA聚類熱圖

6. 已知和新miRNA的靶基因分析。
為了研究鑒定的已知和新miRNA參與的生物學過程，以及分析嫩枝彎曲調控開花誘導的分子機制，通過降解組來鑒定miRNA的靶基因。上文的分析顯示，在對照組和嫩枝彎曲組之間篩選到了41個家族195個已知miRNA。對這些已知miRNA以及它們目標切割位點的具體分布信息進行了分析。同時，鑒定了31個差異表達新miRNA的40個靶標。

新miRNA調控的靶基因包括一些轉錄因子和調控蛋白。如，新m1736-3p的靶基因為編碼一個myb-like的HTH轉錄因子家族蛋白（DUO1）。一些新miRNA調控的靶基因與植物激素相關，如新m1791-5p調控的靶基因為參與CK信號轉導途徑的細胞分裂素響應因子CRF4。此外，一些新miRNA的靶基因參與糖信號轉導和代謝，如新miR1316-5p調控靶基因BGAL3。

 

7. 定量RT-PCR鑒定與AUC、ABA、控制開花相關的差異表達miRNA和靶基因
為了驗證miRNA測序結果的準確性，以及分析在不同發(fā)育時期（ES-MS-LS）miRNA和靶基因的表達水平，我們檢測了在響應嫩枝彎曲時與IAA、ABA、控制開花相關的miRNA和靶基因的表達模式。結果顯示，與IAA、ABA信號轉導相關的miRNA和靶基因可能參與調控響應嫩枝彎曲時蘋果花芽的形成。

 

創(chuàng)新點

1.蘋果樹嫩枝彎曲可以促進產生較多的花芽，嫩枝彎曲是蘋果樹一個非常重要的栽培性狀，研究解析蘋果樹響應嫩枝彎曲的分子機制，有助于解決年輕蘋果樹低質量花芽的問題。
2.結合降解組的數據來分析鑒定miRNA的靶基因，更具有說服力。
3.分析了嫩枝彎曲誘導開花過程中激素含量的變化，并集合miRNA測序數據針對性地分析了激素相關基因的調控作用，深入解析了分子機制。
4.大量qRT-PCR實驗對miRNA和降解組測序數據的驗證。

 

參考文獻

[1] Libo Xing, Dong Zhang, Caiping Zhao, Youmei Li, Juanjuan Ma, Na An and Mingyu Han, (2015) Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.) Plant Biotechnology Journal, pp. 749–770.