回顧2018，百邁客轉(zhuǎn)錄調(diào)控項(xiàng)目文章收獲頗豐：據(jù)不完全統(tǒng)計，已突破百篇，累積影響因子300+，涉及轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、全長轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組、降解組和原核轉(zhuǎn)錄組等。本次項(xiàng)目文章分享中，我們一起走進(jìn)微小生物世界，去看一看里面的大乾坤~

研究背景

擬諾卡氏菌種是從鹽湖或堿性環(huán)境中分離出來的，其中有約三分之二的菌種嗜鹽或耐鹽。在高鹽環(huán)境下，擬諾卡氏菌可通過加固細(xì)胞壁和積累滲透因子等多種方式而使自身得以生存。鹽刺激條件下，滲透因子的累積可使得菌體在不影響其基本細(xì)胞進(jìn)程和常規(guī)代謝的情況下而保持菌體滲透平衡。其中在自然界含量最多的滲透因子便是四氫嘧啶，其可促進(jìn)蛋白折疊，并保護(hù)酶、核酸、抗體等生物分子，使細(xì)胞可應(yīng)對多種壓力環(huán)境。在所有的擬諾卡氏菌種中都有參與四氫嘧啶合成的相關(guān)基因。

材料方法

試驗(yàn)材料：菌種（Nocardiopsisgilva?YIM 90087^T）

試驗(yàn)內(nèi)容：

1、使用不同鹽濃度（0~15%）處理，觀察N.gilva?YIM 90087^T的形態(tài)學(xué)變化、增殖、四氫嘧啶及羥基四氫嘧啶檢測，進(jìn)行表型測定

2、提取中期對數(shù)期YIM 90087^T菌體RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司?Illumina Hiseq

研究結(jié)果

1、鹽含量對N. gilva?YIM 90087T的形態(tài)學(xué)和增殖情況影響

隨著鹽濃度的增高，菌落顏色由黃色變?yōu)榘咨?，且?%的NaCl鹽溶液中生長最佳，鹽濃度高于或低于該濃度，其生長速度均會下降。

 

圖1、菌體表型觀察及生長曲線

2、差異表達(dá)分析

對菌種進(jìn)行二代測序，篩選FDR<0.01，F(xiàn)old Change≥2的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，并使用COG、GO、KEGG、Swissport和NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋分析。通過COG分類，共獲得25個COG組別，其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝是其主要組分。DEGs被分布在34個GO term里，其中包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三大類。與此同時，三個比較組（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）差異表達(dá)基因分別富集到77、32和90條KEGG通路中，其中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝在鹽刺激下扮演相當(dāng)重要的角色。尤其在最大耐受度的NaCl鹽環(huán)境里，參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體通路的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶基因、甜菜堿基因和四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因表達(dá)量都顯著提高。

圖2、三個比較組的（5%/0%, 10%/0%和15%/0%）COG注釋

3、N. gilva?YIM 90087^T菌種ect基因集的遺傳組成

對四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因ectABCD進(jìn)行種屬分析。其中在18個擬諾卡氏菌系中存在2個常見的ectABCD基因簇類型。ectABC屬于一個基因簇，而ectD則位于基因組的其他位置（type A, 15 strains），又或者ectABCD歸屬于相同的基因簇（type B, 3 strains）。此外，在N. potens?DSM 45234和N.prasina?DSM 43845菌系中發(fā)現(xiàn)至少一個ectAB或ectD基因。然而，在N.gilva?YIM 90087^T中，基因簇類型卻與其他菌系顯著不同。ectA基因完全與ectBCD基因簇分開，且ehuABCD（四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)受體基因）位于ectD基因的下游。

圖3、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成基因基因簇

4、參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況

對不同鹽環(huán)境下的參與四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的升高，參與四氫嘧啶合成的基因有不同程度的上調(diào)，尤其在15%的鹽濃度中最顯著。與其他基因不同的是，ectD基因從5%到10%和10%到15%鹽濃度下出現(xiàn)兩次上調(diào)。在N. gilva?YIM 90087^T中發(fā)現(xiàn)有兩個特殊的ABC受體基因（ehuABCD和?proXWV）參與四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)，并隨著鹽濃度的升高而發(fā)生變化。ehuABCD表達(dá)情況與鹽濃度在大于5%以上時成正相關(guān)，而proXWV的表達(dá)量變化在耐受鹽濃度環(huán)境中無變化。有趣的是，ehuABCD和proXWV基因在最大耐受鹽濃度中表達(dá)活性最高。

表1、在不同鹽濃度刺激下四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶合成與轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)情況

5、N. gilva?YIM 90087^T中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的累積

使用HPLC對四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)這兩種物質(zhì)的含量變化會隨著時間累積，且積累程度隨著NaCl濃度的升高而增加。值得注意的是，羥基四氫嘧啶在0或5% NaCl濃度下很難被合成；而48h后，在10%和15%的NaCl培養(yǎng)基中被檢測到。此外，這兩種物質(zhì)含量均會隨著培養(yǎng)時間的增長而增加。96h后，在15%的NaCl濃度培養(yǎng)下，四氫嘧啶（33.14 mg/g CDW）和羥基四氫嘧啶（1.17 mg/g CDW）達(dá)到最高水平。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的含量要比羥基四氫嘧啶的含量分別高42.6和28.3倍。這些結(jié)果表明，四氫嘧啶會在N. gilvaYIM 90087^T的胞內(nèi)累積。

除此之外，對胞外的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶含量進(jìn)行檢測并發(fā)現(xiàn)大量的四氫嘧啶被釋放到細(xì)胞外。96h后，在0、10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，分別釋放了89.20%、92.46%、91.99%和71.09%的四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，有99.31%和99.08%的羥基四氫嘧啶被釋放到胞外。在15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著增強(qiáng)，而羥基四氫嘧啶的轉(zhuǎn)運(yùn)能力則隨著濃度的增加未出現(xiàn)顯著變化。此外，研究表明，將四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶的能力會隨著鹽濃度的增加而增強(qiáng)，在15%的鹽濃度環(huán)境下，有50%的四氫嘧啶轉(zhuǎn)化為羥基四氫嘧啶，并在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的胞外含量最高。

圖4、N. gilva?YIM 90087^T菌種中四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的產(chǎn)生統(tǒng)計

6、外源四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶對N.gilva?YIM 90087^T生長的影響

在鹽刺激下，添加外源的四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會促進(jìn)菌種的生長速度。在最適宜的鹽濃度環(huán)境下，添加四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶會輕微促進(jìn)OD₆₀₀值，而在高濃度鹽環(huán)境下，外源物會顯著促進(jìn)OD₆₀₀值。其中添加外源羥基四氫嘧啶對菌種的生長速度促進(jìn)作用優(yōu)于外源四氫嘧啶。

7、大腸桿菌中四氫嘧啶累積

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，發(fā)現(xiàn)在15%的NaCl緩沖液中，四氫嘧啶很難產(chǎn)生，并在0%的緩沖液中檢測到少量四氫嘧啶。在10%和15%的鹽濃度環(huán)境下，四氫嘧啶的合成速率分別在24h和48h中顯著下降，其最大合成速率為[0.5 mg (g CDW)^?1?h^?1]，而最終產(chǎn)出[28.85 mg (g CDW)^?1]?。

總結(jié)

本文通過對N.gilva?YIM 90087^T在不同鹽濃度環(huán)境下的綜合分析，發(fā)現(xiàn)鹽刺激可導(dǎo)致菌落顏色發(fā)生變化。添加外源的四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶，在高濃度鹽環(huán)境下，可對N. gilva?YIM 90087^T起到保護(hù)作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶的合成和累積可調(diào)控滲透壓力，并隨著NaCl濃度的升高合成量增大。

 

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