納米孔測序是一種由ONT（Oxford Nanopore Technology）研發(fā)的單分子測序技術(shù)。在轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用中，相比于傳統(tǒng)二代RNA-Seq測序技術(shù)，長讀長的納米孔RNA測序可以在無需打斷的條件下得到全長序列并進行定量，同時直接RNA測序還可以檢測多種堿基修飾，且測序無需擴增，減少了PCR過程引入的堿基偏倚。

ONT測序技術(shù)在多個方面具有非常強悍的優(yōu)勢，然而，一份合格的下機數(shù)據(jù)才是科研成功研究的基礎(chǔ)，為保證得到準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)分析和定量結(jié)果，需要對測序數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格的質(zhì)控評估。那么我們今天一起學(xué)習(xí)一下《Summary statistics and QC tutorial》，ONT官方提供的對測序raw?data進行全面數(shù)據(jù)質(zhì)控的教程。

介紹

此教程適用于指導(dǎo)對單個nanopore測序芯片產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進行評估，評估的主要內(nèi)容如下所示：

1、測序產(chǎn)出（測序得到多少reads，多大數(shù)據(jù)量）；

2、測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和長度分布；

3、如果加入了barcode序列進行混樣建庫，測序數(shù)據(jù)在不同樣品的分布。

準(zhǔn)備

1、下載教程相關(guān)文件

直接到教程的github頁面下載或通過git命令下載：

git clone https://github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc.git QCTutorial

后續(xù)分析會用到下載目錄QCTutorial下的以下內(nèi)容：

1) Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd：Rmarkdown文件，說明文檔和用于執(zhí)行分析。

2) RawData/lambda_sequencing_summary.txt.bz2：示例文件，Guppy對測序reads進行堿基識別生成的相關(guān)信息文件。

3) RawData/lambda_barcoding_summary.txt.bz2：示例文件，用于區(qū)分混樣建庫時多樣品的barcode信息。

4) environment.yaml：指定分析所需軟件包及計算環(huán)境的文本文檔。

5) config.yaml：配置文件，用于指定分析所需的輸入。

2、創(chuàng)建Conda環(huán)境

為了方便執(zhí)行分析所需軟件包及其依賴的安裝及管理，需要安裝Conda并創(chuàng)建用于此分析的環(huán)境。

1)?Conda安裝（Python3版本的Miniconda）：

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash

2)?創(chuàng)建Conda環(huán)境及環(huán)境激活（第1步中下載的environmen.yaml用于環(huán)境初始化）：

創(chuàng)建環(huán)境：conda env create –name BasicQC –file environment.yaml

激活環(huán)境：source activate BasicQC

分析

進行分析之前需先準(zhǔn)備配置文件，通過修改準(zhǔn)備步驟下載的config.yaml中相應(yīng)的參數(shù)來完成，需要修改的內(nèi)容主要有：

 

注：如為單樣品測序無barcode信息，則barcodeFile部分為空。

準(zhǔn)備完成后，可以通過命令行啟動分析，命令如下：

R –slave -e ‘rmarkdown::render(“Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd”, “html_document”)’

如果習(xí)慣圖形界面操作，也可以通過Rstudio載入Rmarkdown文件執(zhí)行分析：

結(jié)果

上述分析完成后會將分析結(jié)果存放至HTML文件，可用瀏覽器打開Nanopore_SumStatQC_Tutorial.html進行查看。對單個芯片約1M reads分析的部分結(jié)果展示如下（結(jié)果來自教程，堿基識別使用Guppy 2.1.3，根據(jù)識別序列的平均質(zhì)量值將其分為pass和fail兩種，質(zhì)量值閾值默認(rèn)為7）：

1、總結(jié)

展示了數(shù)據(jù)產(chǎn)出的總體情況（如下圖，本分析中堿基識別共產(chǎn)出991,715條序列，14.6G堿基）。

2、質(zhì)量長度

此部分展示了對識別出的所有序列質(zhì)量和長度信息的統(tǒng)計結(jié)果，包括序列的平均長度，N50和平均質(zhì)量，序列長度和質(zhì)量的密度分布等

3、測序表現(xiàn)

此部分內(nèi)容統(tǒng)計了隨測序時間變化，測序累計序列個數(shù)，堿基個數(shù)，測序速度和有效工作納米孔數(shù)等指標(biāo)的變化情況。

4、區(qū)分混樣

在加入barcode序列混樣測序的情況下，barcode識別區(qū)分的結(jié)果展示如下，包括barcode識別效率，區(qū)分的文庫個數(shù)及每個文庫中序列個數(shù)占比和長度信息等。

上面展示了分析結(jié)果的部分內(nèi)容，更多細節(jié)的內(nèi)容可參考底部的相關(guān)鏈接。

rawdata的質(zhì)控評估只是整個信息分析的開始，是為了對測序數(shù)據(jù)有大致的整體認(rèn)識，以便更好地指導(dǎo)后續(xù)分析。然而分析的每個環(huán)節(jié)都會對最終結(jié)果產(chǎn)生影響，因此每一步的處理都要深思熟慮。

小編寄語

2018年8月牛津納米孔公司與百邁客公司達成長期合作，擁有MinION、GridION X5和PromethION三種型號全套納米孔測序儀。至今已積累了豐富的項目經(jīng)驗，全長轉(zhuǎn)錄組成功案例先后發(fā)表在《Plant Biotechnol J》、《J Hazard Mater》、《Biotechnol Biofuels》、《Sci Rep》、《Fish & Shellfish Immunology》等國際知名期刊，已發(fā)表文章研究物種分別有楊樹、吳松草、風(fēng)箏果、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔紅點鮭和辣椒，覆蓋領(lǐng)域分別為林木、哺乳動物、昆蟲、水產(chǎn)和作物等。

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參考鏈接:

https@//github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc(@換成:)

https@//community.nanoporetech.com/knowledge/bioinformatics(@換成:)