對于高通量技術(shù)大家一定都不陌生，但生物信息分析之后該做什么呢？本文和大家探討并分享高通量測序后的實驗驗證，即該用什么技術(shù)做什么驗證！

先和大家探討最常見的轉(zhuǎn)錄組測序后的驗證方法。轉(zhuǎn)錄組的驗證方法有點多（如表達量驗證、亞細胞定位、RNA結(jié)合蛋白、功能獲得驗證、功能缺失驗證等），本篇只先介紹表達量驗證、RNA結(jié)合蛋白、亞細胞定位，其余的下期見！

表達量驗證

一般情況我們優(yōu)先選擇高表達量的RNA，以及差異表達明顯的RNA去驗證。去驗證某個基因或者RNA的表達量時，需要保證沒有基因組DNA的污染。PS:如果是非編碼RNA驗證，由于他們可能不含polyA尾巴，所以要注意反轉(zhuǎn)錄方式。

qRT-PCR

設計引物RNA進行qRT-PCR。

哈哈哈，如果你和小編一樣曾是生信dog，我相信你一定一臉懵逼，我連PCR到底是啥能干啥都不知道，你跟我說qRT-PCR!

小編以一個實驗編外人士跟你通俗易懂的科普一下，PCR是設計引物判斷某個DNA序列是否存在的技術(shù)；RT-PCR對RNA進行反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription）得到cDNA后，以cDNA為模板進行PCR反應，進而判斷某個RNA序列是否存在的技術(shù)；qPCR不只判斷DNA是否存在，還能判斷含量高低，qRT-PCR即quatitative RT-PCR，是判斷RNA是否存在以及含量高低的技術(shù)！

總結(jié)一句話，PCR都得設計引物，帶RT就是研究RNA,不帶RT就是研究DNA，帶q就是定量，不帶q就是定性！至于他是咋定量的呢，劃重點，靠內(nèi)參??！

Northern blot

Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。PS:?Northern blot樣品需除去RNA酶。

小編再給大家科普一下下，Western Blot做蛋白，Southern Blot做DNA，Eastern blotting是Western Blot的變形也是作蛋白，不過沒得到廣泛認可。

靈敏度：qRT-PCR?>?Northern blot

特異性：Northern blot?>?qRT-PCR

RNA和蛋白互作驗證

RNA結(jié)合蛋白（RNA Binding Protein）是一類伴隨RNA的調(diào)控代謝過程，與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱。RBP伴隨RNA生命始終，其主要作用是介導RNA的成熟、轉(zhuǎn)運、定位和翻譯；一個RBP可能存在多種靶標RNA；且其表達缺陷會造成多種疾病。RNA與蛋白相互作用是RNA功能研究的焦點問題之一。

RNA-pull down

已知RNA，尋找結(jié)合蛋白。

RNA pull-down實驗就是先將RNA進行標記（如生物素探針標記）再與蛋白共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復合物，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，最后通過WB(western blot)或質(zhì)譜（mass Spectrometry）檢測蛋白質(zhì)。

該技術(shù)用于尋找與目的RNA結(jié)合的蛋白。

RIP

已知蛋白，尋找RNA。

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）技術(shù)采用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，經(jīng)分離純化對RNA進行分析。

該技術(shù)用于尋找與目的蛋白結(jié)合的RNA。

EMSA

已知RNA,已知蛋白，判斷是否結(jié)合。

EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝膠遷移）技術(shù)是通過凝膠電泳遷移檢測蛋白-RNA互作的一種技術(shù)。

首先將設計好的帶有標記的RNA探針與樣本蛋白混合孵育，形成蛋白-RNA復合物。因復合物分子量大，會在聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，來確定RNA結(jié)合蛋白的特異性。

該技術(shù)用于體外驗證預測的RNA與蛋白之間是否能夠結(jié)合。

亞細胞定位研究

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位，例如在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細胞膜上存在。越來越多的證據(jù)顯示，在生物學過程中位于不同的亞細胞器RNA擁有不同的功能，亞細胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。

RNAFISH

RNAFISH，即RNA的免疫熒光原位雜交，是將已標記的RNA探針（可在探針上標記熒光基團、生物素、地高辛等）與組織切片或細胞中的待測RNA中的互補序列雜交,從而對組織細胞中的RNA進行定性、定位和相對定量分析。

數(shù)據(jù)庫

偷偷的告訴你，RNALocate數(shù)據(jù)庫（http://www.rna-society.org/rnalocate）收錄了超過42,000個人工收集的RNA的亞細胞定位信息，包含超過23,100個RNA，在65個物種中的42個亞細胞定位。lncATLAS數(shù)據(jù)庫（http://lncatlas.crg.eu/）則是一個專門收錄lncRNA亞細胞定位的數(shù)據(jù)庫。有需要的可以先去查詢！

參考文獻：

Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).

Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.

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