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提問1：我的qPCR實驗結果，復孔重復新性差，具體是什么原因導致的？

回復： 1）誤差導致，建議加樣過程中，使用精密的移液器，且可增大反應體系。

2）儀器長時間未校準，建議將儀器定期校準。

提問2：擴增曲線未達到平臺期，如何改善？

回復： 1）模板量太低，可適當增加模板量。

2）循環(huán)數(shù)太少，可適當增加循環(huán)數(shù)。

3）基因表達豐度低，建議增加模板量，或者選擇合適的試劑盒，確保 能檢測出較低基因的表達水平。

除此之外，在qPCR擴增實驗過程中，還會出現(xiàn)Ct值偏大、特異性差、熒光強度弱、不適合特有的機型等問題。為了解決以上問題，百邁客推出的一款Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒，具有全平臺通用、特異性強、擴增性能優(yōu)越、靈敏度高等特點。

產(chǎn)品簡介

Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix采用SYBR? Green I 嵌合熒光法進行qPCR反應，通過對SYBR? / FAM通道進行熒光信號定量檢測，可以獲得PCR過程中DNA擴增的真實數(shù)據(jù)。Taq DNA酶采用抗體法熱啟動進行擴增，可以有效抑制引物退火導致的非特異性擴增，極大地提高產(chǎn)品的特異性。且試劑盒中含有特殊的ROX Reference Dye，適用于所有qPCR儀器。

產(chǎn)品特點

1.兼容性完美，全平臺通用：提供ROX Reference Dye I和II預混液，適用于所有主流定量PCR儀器。

2.靈敏度高：采用獨特優(yōu)化的反應Buffer，可檢測低至10 pg的cDNA模板。

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圖1：將質粒進行8個10倍梯度稀釋，以5×107~100拷貝/μl的質粒為模板，進行擴增。發(fā)現(xiàn)擴增效率高，且可獲得良好的線性關系。

3.擴增性能優(yōu)越：短時間內(nèi)可反復凍融10次以上，擴增曲線依然呈現(xiàn)特征單峰，擴增效率依然很高。

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圖2：以1 μg不同物種的RNA為模板（藍色：人肝癌細胞；青色：雞；紅色：斑馬魚；黑色：水稻種子），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100 ng不同物種的 cDNA為模板，用反復凍融10次以上的Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix進行qPCR擴增。

4.特異性強，適應不同樣本：通過抗體封閉聚合酶活性，有極強的特異性，可完美識別植物（種子、葉子、果實）、動物（細胞、組織）等樣本的目標基因擴增。

圖3：以1 μg不同物種的RNA為模板（紅色：人肝癌細胞；藍色：雞；黑色：斑馬魚；紫色：水稻種子；黃色：番茄果），用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100 ng不同物種的 cDNA為模板，用Biomarker 2×SYBR Green Fast qPCR Mix進行qPCR擴增。

5. 重復性好 ：設置20個復孔，S型擴增曲線幾乎重合。

圖4：以1μg水稻種子的RNA為模板，用BiomarkerScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，得到cDNA產(chǎn)物。再以100 ng的 cDNA為模板，設置20個復孔，用Biomarker 2× SYBR Green Fast qPCR Mix進行qPCR擴增。

轉錄組項目文章發(fā)表，大部分的驗證都采用了qPCR方案，統(tǒng)計部分百邁客成功案例：人、鼠、家禽、水產(chǎn)、昆蟲、經(jīng)濟作物、林木、花卉果蔬等。

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